研究背景
高脂饮食(HFD)会引起肥胖和心脏畸形，表现为心肌肥大、心室顺应性丧失和收缩保持能力丧失，同时伴有显著的线粒体损伤和各种形式的细胞死亡。虽然已经推测了摄入HFD和肥胖导致的不利心肌后遗症的多种情况，包括脂*性、炎症、氧化应激、细胞凋亡、坏死、内质网应激、氧化DNA损伤和自噬紊乱，但肥胖相关心脏病理的确切机制仍然不清楚。最近的证据表明，铁死亡是一种新的调节性细胞死亡形式，其特征是铁基脂质活性氧(ROS)的积累，在肥胖和肥胖并发症(包括血管钙化、癌症发展、神经、肾脏和肝脏损伤)中可能起到作用。
更多的证据表明，自噬，一种在应激、饥饿或缺氧中维持细胞内稳态的保守进化过程，与病理环境中铁死亡的诱导密切相关。据报道，自噬货物受体核受体辅活化子4(NCOA4)特异性地靶向铁蛋白到自噬小体，促使携带铁蛋白的成熟自噬小体和溶酶体合并以降解铁蛋白，这一过程被称为铁蛋白吞噬，以控制铁的释放和再循环。
线粒体自噬是选择性吞噬/清除长寿命或受损线粒体的过程，是主要的线粒体质量控制机制，控制线粒体数量、代谢重编程和细胞分化。有报道称，受体介导的和帕金森依赖的自噬，如BCL2/腺病*E1B19kDa蛋白相互作用蛋白3(BNIP3)和包含1的FUN14结构域(FUNDC1)介导的自噬。线粒体自噬失调可能引起心血管和代谢异常的发展，如酒精性心肌病、肥胖和2型糖尿病。
研究结果
1.饮食诱导的肥胖影响心脏的铁死亡和线粒体自噬，并在肥胖的人类和啮齿动物心脏中得到证实
为了了解肥胖生物学途径的可能变化，成年Sprague-Dawley大鼠在RNA-SEQ评估之前被置于HFD20周。用KEGG富集分析检测LFD组和HFD组之间的差异表达基因(DEG)。在摄入HFD后，肥胖心脏中观察到与铁死亡、线粒体自噬和氧化磷酸化相关的基因富集(图1A-C)，表明这些生物途径在肥胖相关心脏并发症中可能起作用。为了解释铁死亡和线粒体自噬在肥胖心脏异常中的作用，在肥胖的人和啮齿动物的心脏中评价了铁死亡和线粒体自噬的蛋白标记物。结果显示，在肥胖的人和啮齿动物中，铁死亡(Gpx4和SLC7A11的下调)伴随着抑制的线粒体自噬(TOM20的增加)(图1D-P)。结果表明，铁死亡和抑制线粒体自噬在肥胖相关的心脏损伤中可能起到了作用。
图1
2.高脂饲料喂养的WT和FundC1?/?小鼠在铁死亡抑制剂LIP-1治疗前后的代谢特性
鉴于早先的报告揭示了线粒体自噬受体FUNDC1在肥胖心肌病中的作用，作者继续使用短期(10周)高脂饮食摄入方案，在WT和FUNDC1?/?小鼠中研究了在补充或不补充铁死亡抑制剂LIP-1的情况下，抑制线粒体自噬和升高的铁死亡之间的可能相关性。在饮食喂养8周和10周时，摄入HFD引起体重增加明显增加，同时血清甘油三酯略有增加，但不影响HOMA-IR和血清Fe2+水平，尽管增加幅度很小，但并不影响HOMA-IR和血清Fe2+水平。尽管FUNDC1缺乏对HFD诱导的体重增加以及血清甘油三酯和Fe2+水平没有影响，但它揭示了HFD诱导的HOMA-IR和血清Fe2+水平的升高，这一效应不受LIP-1补充的影响。FUNDC1缺乏本身不会影响LFD摄入下的任何生物特征或血清特征(图2A-D)。为了进一步评估HFD和FUNDC1缺乏诱导的代谢行为，使用CLASM监测了24小时周期内的全球代谢。这些数据没有注意到短期HFD摄入或FUNDC1消融本身(LFD摄入)在O2消耗、CO2产生、RER比率、热量产生和总活动方面有任何明显的变化，尽管FUNDC1缺乏揭示了HFD导致的O2消耗、CO2产生、RER比率和热量产生的下降，而不影响总的体力活动，LIP-1可以避免这些影响(图2E-T)。这些数据表明，FUNDC1缺乏可能在全球范围内敏化短期HFD诱导的代谢异常，而不依赖于铁死亡。
图2
3.LIP-1对高脂饲料诱导的WT和FundC1?/?小鼠脂质堆积、心脏重构和氧化应激的影响
用油红染色法检测LFDor-HFD喂养的WT和FUNDC1?/?小鼠在LIP-1治疗前后的脂质沉积。数据如图3所示，显示摄入10周HFD后，小鼠心脏几乎没有油红O蓄积，心脏重构和氧化应激。尽管FUNDC1消融对LFD摄入量下的脂质沉积没有影响，但它揭示了HFD摄入量下油红O染色的明显上升，其影响可被LIP-1治疗缓解(图3A，F)。在LFD方案下，FUNDC1缺乏可持续暴露高脂血症引起的心肌肥厚(图3B，G)、间质纤维化(图3C，H)、氧化应激(图3D，I)和线粒体O2?产生(图3E，J)，而在LFD方案下，FUNDC1消融本身几乎没有影响。有趣的是，抑制铁死亡减轻了FUNDC1缺乏-面对HFD摄入时的心肌肥大、间质纤维化和氧化应激，而LFD摄入下LIP-1本身几乎没有影响(图3)。
图3
4.LIP-1对高脂饲料诱导的WT和FundC1?/?小鼠超声心动图、心肌细胞和细胞内钙离子反应的影响
超声心动图评估显示，服用HFD10周后，心肌几何和功能变化很小，尽管FUNDC1缺乏对LFD方案下测试的任何超声心动图指标没有影响，但它明显增加了左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)和左心室重量(绝对或归一化)，降低了缩短分数和射血分数，而心率和室壁厚度没有任何变化。LIP-1单独未能改变LFD下心脏的几何形状或功能，尽管它挽救了FundC1?/?小鼠高脂血症诱导的超声心动图异常(图4A-G)。LIP-1和FUNDC1缺乏引起的左心室质量变化与正常心脏重量的测量一致(图4H-J)。
图4
心肌细胞力学特性的进一步评估显示，摄入HFD和消融FUNDC1对心肌细胞收缩功能均无明显影响。然而，FUNDC1缺乏明显降低了HFD摄入时的峰值缩短、缩短/再延长的最大速度(±dL/dt)和延长再延长的持续时间(TR90)，而不影响静息细胞长度和缩短持续时间(TPS)，LIP-1可减轻这一影响。LFD摄入下，LIP-1本身不对心肌细胞产生任何机械效应(图5A-F)。为了破译LIP-1对FUNDC1消融引起的HFD摄入有害影响的保护机制，用荧光染料Fura-2评估了细胞内Ca2+的处理。结果表明，无论是摄入高脂饲料还是去除FUNDC1，细胞内钙的性质几乎没有变化，尽管FUNDC1缺乏揭示了高脂饲料引起的细胞内钙离子水平(ΔFFI)的下降，并延长了细胞内钙清除率，而不影响静息的细胞内钙水平，这一效应可被LIP-1拯救，而LIP-1本身几乎没有作用(图5G-I)。
图5
5.LIP-1对高脂饲料致WT和FundC1?/?小鼠超微结构改变、线粒体功能和TUNEL凋亡的影响
用透射电镜、乌头酸酶法和TUNEL染色法分别检测肌节和线粒体的超微结构、线粒体功能和细胞凋亡。HFD摄取和FUNDC1消融对心肌超微结构均无明显影响。有趣的是，在高脂饲料喂养的FUNDC1?/?心肌中观察到明显的细胞结构异常，如线粒体肿胀，嵴碎裂，肌节和心肌细丝变形，这些作用被LIP-1抵消，而LIP-1在LFD摄入下对超微结构的影响很小(图6A，C-D)。这与线粒体乌头酸酶活性、线粒体蛋白PGC-1α和UCP-2的变化是一致的，在这些变化中，FundC1缺乏暴露的乌头酸酶活性、PGC-1α和UCP-2水平在高脂饮食摄入时下降，其作用被LIP-1所抵消。LIP-1本身或FUNDC1消融并不影响LFD摄入下的乌头酸酶活性、PGC-1α和UCP-2水平(图6E-G)。最后，无论是HFD摄入还是FUNDC1消融，或两者都没有对心肌细胞凋亡产生任何显著影响，TUNEL染色证实了这一点(图6B，H)。
图6
6.LIP-1对高脂饲料诱导的WT和FundC1?/?小鼠细胞内钙调节蛋白、坏死、细胞凋亡、炎症、自噬、线粒体自噬、脂质过氧化信号、铁死亡和氧化损伤的影响
为明确FUNDC1缺乏致心肌重塑和收缩异常与HFD摄入有关的细胞信号机制，对细胞内Ca2+调节蛋白、坏死、凋亡、炎症、自噬、线粒体自噬、脂质过氧化调节信号、铁死亡和DNA氧化损伤等蛋白标记物进行了检测。没有注意到这些蛋白标记物在HFD摄入或FUNDC1缺乏的情况下有任何变化。然而，FundC1消融暴露了SERCA2a和RyR2的下调，磷蛋白和Na+-Ca2+交换器(NCx)的上调，坏死(RIPK1和RIPK3)和炎症(TNF-α和IL-6)的上调，而对细胞凋亡没有影响。虽然LIP-1本身不影响这些蛋白质标记物，但它有效地抵消了FUNDC1消融-细胞内钙调节蛋白(SERCA2a、磷蛋白、NCX和RyR2)的未被掩盖的变化、坏死、炎症，而不影响HFD摄入下的细胞凋亡(图7A-j)。
图7
作者进一步检测了自噬、线粒体自噬、脂质过氧化信号分子、铁死亡和DNA氧化损伤等蛋白质标志物。虽然这些蛋白标记物在HFD摄入或FUNDC1缺乏时几乎没有变化，但FUNDC1消融暴露出明显抑制自噬和线粒体自噬，以及面对HFD摄入时上调的脂质过氧化调节分子SP1和ACSL4，铁死亡和下调的8-氧鸟嘌呤氧化DNA损伤行使酶OGG1。虽然LIP-1本身不影响这些标志物，但它有效地否定了FUNDC1消融未被掩盖的铁死亡和氧化DNA损伤的变化，而不影响自噬、线粒体自噬、SP1和ACSL4的水平(图8A-J)。
图8
7.FundC1缺失通过SP1-ACSL4和铁死亡依赖机制增敏花生四烯酸诱导的细胞色素c释放和心肌细胞功能障碍
考虑到线粒体在心肌细胞功能中的重要作用，监测WT和FundC1?/?小鼠在没有或存在Sp1抑制剂托芬奈酸(TA，50μM)、ACSL4抑制剂TriacsinC(TC，10μM)或铁死亡抑制剂LIP-1(NN)的情况下，用ACSL4底物AA(1μM，24小时)攻击WT和FundC1小鼠的新生心肌细胞中细胞色素C的共定位(释放)。选择AA而不是棕榈酸等游离脂肪酸进行体外研究的理由很大程度上是基于在体内的结果发现ACSL4上调(图8A和G)。定量分析表明，AA不能引起细胞色素C释放的改变，FUNDC1缺乏公开揭露AA诱导的细胞色素C从线粒体释放，其作用被SP1，ACSL4和铁死亡的药理抑制所抵消，而抑制剂本身的影响很小(图9A-B)。对成年小鼠心肌细胞功能的进一步评估显示，FUNDC1缺乏明显暴露了AA(孵育8h)引起的心肌细胞功能障碍(PS降低，±dL/dt，延长TR90)，其作用可被抑制SP1，ACSL4和铁死亡缓解，而抑制剂本身的作用很小(图9C-F)。
图9
8.FundC1缺失通过SP1-ACSL4依赖机制增敏花生四烯酸诱导的脂质过氧化
为了评价FundC1和Sp1-ACSL4信号级联在心肌细胞脂质过氧化中的作用，用BODIPY荧光技术对WT和FundC1?/?小鼠乳鼠心肌细胞进行了ACSL4底物AA(1μM，作用24h)攻击，并在没有或存在Sp1抑制剂TA(50μM)、ACSL4抑制剂TC(10μM)或铁死亡抑制剂LIP-1(NM)的情况下，对WT和FundC1小鼠的新生心肌细胞进行了BODIPY荧光检测。数据显示，虽然AA不影响脂质过氧化，但FUNDC1缺乏暴露了AA诱导的脂质过氧化升高，其作用可被SP1、ACSL4和铁死亡的抑制所消除，而这些抑制剂本身几乎没有影响(图10A-B)。
图10
总结
差异表达基因(Degs)的RNAseq分析报告了肥胖大鼠心脏中铁死亡和线粒体自噬相关的基因本体论术语，并在肥胖啮齿动物和人类心脏中得到验证。尽管摄入10周的HFD没有改变整体代谢、心脏几何和功能、消融FUNDC1未被掩盖的代谢紊乱、在HFD挑战时明显的心脏重构、收缩、细胞内Ca2+和线粒体异常，但LIP-1可减弱或减轻除整体代谢外的这些影响。除ACSL4及其调节因子Sp1外，LIP-1可逆转脂肪酸合成酶ACSL4、坏死、炎症、铁死亡、线粒体O2?生成和线粒体损伤，抑制自噬和DNA修复酶8-oxoGDNA糖基化酶1(OGG1)，但不能抑制细胞凋亡，但对细胞凋亡无明显影响(除ACSL4及其调节因子Sp1外，其余作用均可被LIP-1逆转)，但不能抑制自噬和DNA修复酶8-oxoGDNA糖基化酶1(OGI1)的表达，除ACSL4及其调节因子Sp1外，LIP-1可逆转上述作用。体外实验数据表明，ACSL4底物花生四烯酸在FUNDC1缺乏时可引起细胞色素C释放、心肌细胞缺损和脂质过氧化，这种作用可被SP1、ACSL4和铁死亡抑制剂阻断。这些数据表明，短期接触HFD后，FUNDC1缺乏可能通过ACSL4介导的铁死亡调节，使心脏重塑和功能障碍变得敏感。
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